PCR (výzkum) - aplikace. Co je technika PCR?

PCR je test, který se používá při diagnostice mnoha nemocí. Metoda PCR umožňuje ukázat přímou přítomnost bakterií v organismu, konkrétně jeho DNA. Používá se mimo jiné testování PCR v diagnostice lymské boreliózy. Co je technika PCR? Co je to PCR v reálném čase?

Obsah:

1. PCR (testování) - jaká je technika PCR?
2. PCR (výzkum) - aplikace metody PCR
3. PCR (výzkum) - borelióza
4. PCR (výzkum) - výsledky. Mohou to být falešně pozitivní výsledky?
5. PCR (výzkum) - výsledky. Mohou být falešně negativní

PCR (polymerázová řetězová reakce) je základní metodou používanou v genetických a molekulárních laboratořích. Byl vyvinut v roce 1983 Karou Mullisovou, která za něj v roce 1993 získala Nobelovu cenu.

Poslechněte si, o čem je technika PCR. Toto je materiál z cyklu LISTENING GOOD. Podcasty s tipy.

Chcete-li zobrazit toto video, povolte JavaScript a zvažte upgrade na webový prohlížeč, který podporuje video

PCR (testování) - jaká je technika PCR?

Testování PCR spočívá v mnohonásobné amplifikaci (obvykle v 30-40 cyklech) specifického fragmentu DNA, např. Genů kódujících proteiny Borrelia, s použitím polymerázového enzymu.

Poté se ke zviditelnění fragmentu amplifikované DNA použijí speciální molekulární barviva. PCR, díky amplifikaci specifických fragmentů DNA, je ultracitlivá metoda.

V metodě PCR jsou fragmenty DNA amplifikovány pomocí specifických párů primerů pro danou oblast bakteriální DNA. Například cílové oblasti v PCR používané při diagnostice lymské boreliózy jsou geny kódující proteiny, např. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biologický materiál, ze kterého lze provést zkoušku, je:

• krev
• část kůže z migrujícího erytému
• mozkomíšní mok
• synoviální tekutina nebo z kloubní chrupavky
• moč

PCR (výzkum) - aplikace metody PCR

Kromě diagnostiky lymské boreliózy pomocí metody PCR je možné detekovat specifické fragmenty DNA jiných mikroorganismů nebo lidí. Proto se metoda PCR používá také v:

• diagnostika a sledování virových infekcí: herpesviry (herpes virus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, viry hepatitidy (HBV a HCV)
• diagnostika a sledování bakteriálních infekcí, zejména těch bakterií, které nelze identifikovat kultivací, např. tuberkulóza
• diagnostika a sledování neoplastických onemocnění: leukémie, rakovina prsu, kolorektální rakovina, rakovina plic
• diagnóza predispozice k rakovině: rakovina prsu a vaječníků (geny BRCA1 a BRCA2), kolorektální karcinom (geny APC a CHEK2)
• diagnostika genetických chorob: hemochromatóza (gen HFE), talasémie (geny HBA1 a HBA2), celiakie (geny HLA)
• testy otcovství, které detekují DNA kompatibilitu dítěte a otce

Přečtěte si také: Testy na lymskou boreliózu - jak vypadají a jaká je cena testů na lymskou boreliózu Western blot test a boreliózu. Interpretace výsledků testu Choroby přenášené klíšťaty: borelióza, babezióza, bartonelóza, TBE a další.

V současné době existuje mnoho modifikací metody PCR. Například v diagnostice Lyme choroby se používají hlavně metody nested PCR (nested PCR) a real-time PCR. Jedná se o kvantitativní metodu, která umožňuje určit přesný počet kopií DNA borelie v testovaném biologickém materiálu.

PCR (výzkum) a borelióza

Sérologické testy jsou základem pro diagnostiku lymské boreliózy. Existují však klinické situace, které mohou způsobit, že tyto testy budou falešně negativní:

• sérologické okno, tj. počáteční období infekce, ve kterém tělo ještě neprodukuje specifické protilátky IgM a IgG proti spirochetám Borrelia
• u lidí s imunodeficiencí, kteří neprodukují dostatek protilátek
• přítomnost imunitních komplexů, které se skládají z antigenů Borrelia a specifických protilátek proti nim, a brání detekci protilátek sérologickými metodami

Pokud jsou u pacienta podezření na příznaky lymské boreliózy a výsledky sérologických testů jsou negativní, lze provést molekulární testování založené na metodě PCR.

DNA spirochet Borrelia lze detekovat v rané fázi infekce, protože počet spirochet v tělních tekutinách je pak nejvyšší.

Při diagnostice lymské boreliózy se primárně používají sérologické metody, jako je ELISA, ale v některých klinických situacích jsou užitečné genetické testy využívající metodu PCR.

Čím delší je doba od infekce, tím menší je pravděpodobnost detekce bakteriální DNA. Proto se v některých případech před provedením testu PCR bakterie pěstují na speciálním médiu po dobu 1–2 týdnů a poté se test provede.

Tento přístup se používá v případě podezření na lymskou boreliózu a odebraný mozkomíšní mok. V pozdní fázi infekce je vhodnější provést test ELISA.

Metoda PCR by se neměla používat při rutinní diagnostice lymské boreliózy kvůli nedostatečné standardizaci týkající se výskytu odrůd Borrelia burgdorferi v Polsku.

V případě obtíží s diagnostikou (zejména v časném stadiu onemocnění) však výsledek testu PCR pomáhá v diagnostickém procesu.

Pozitivní výsledek testu znamená, že v testovaném materiálu byla detekována přítomnost DNA Borrelia burgdorferi a jejích odrůd, ale nevysvětluje, zda je tělo aktivně infikováno. Na druhé straně negativní výsledek nevylučuje přítomnost bakterií v těle.

Některé laboratoře nabízejí testování na přítomnost DNA Borrelia v klíště. Výsledek takového vyšetření však není základem pro diagnostiku lymské boreliózy u ukousnuté osoby.

Doporučený článek:

Test ELISA - co detekuje? Jak číst výsledky? Cena testu

Výsledky PCR. Mohou to být falešně pozitivní výsledky?

PCR je velmi citlivá metoda a zároveň velmi citlivá na kontaminaci. Proto je v testech založených na PCR velmi důležité vybrat vhodnou interní kontrolu k vyloučení falešně pozitivních výsledků.

Klíčem je také správný sběr materiálu pro testování, jakož i zkušenosti a spolehlivost diagnostika provádějícího test.

Výsledky PCR. Mohou být falešně negativní

Jako v každém laboratorním testu, i v metodě PCR se mohou objevit falešně negativní výsledky. Zde je zásadní odebrat krev pro vhodné antikoagulant, protože některé z nich, jako je heparin, mohou inhibovat PCR reakci.

Sběr materiálu po zahájení antibiotické terapie může také způsobit snížení účinnosti PCR reakce a větší pravděpodobnost falešně negativních výsledků.

Mělo by se také pamatovat na to, že bakterie Borrelia žijí velmi krátce v krvi a tělesných tekutinách, protože díky speciálním receptorům velmi rychle pronikají na „těžko dostupná“ místa v těle.

Na rozdíl od diagnostiky jiných mikroorganismů je proto počet spirochet Borrelia v biologickém materiálu malý, někdy dokonce na hranici detekce metody PCR. To může také způsobit falešně negativní výsledek.

Doporučený článek:

Test transformace lymfocytů (LTT)

Literatura

1. Dunaj J. a kol. Význam metody PCR v diagnostice lymské boreliózy. Procházet Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Laboratorní diagnostika chorob přenášených klíšťaty. Doporučení pracovní skupiny: Národní komora laboratorních diagnostiků, Národní ústav veřejného zdraví - Národní ústav hygieny, Národní konzultant v oblasti infekčních nemocí, Ústav infekčních nemocí a neuroinfekcí, Lékařská univerzita v Białystoku, Polská virologická společnost, Varšava 2014.
3. Ružić-Sabljić E. a Cerar T. Pokrok v molekulární diagnostice lymské boreliózy. Expert Rev Mol Diagn. 2017 Jan; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Principy a aplikace polymerázové řetězové reakce v lékařských diagnostických oborech: přehled. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.

O autorovi

Karolina Karabin, MD, PhD, molekulární biolog, laboratorní diagnostik, Cambridge Diagnostics Polska Biolog se specializací na mikrobiologii a laboratorní diagnostik s více než 10 lety zkušeností v laboratorní práci. Absolvent Fakulty molekulární medicíny a člen Polské společnosti pro lidskou genetiku, vedoucí výzkumných grantů v Laboratoři molekulární diagnostiky na Ústavu hematologie, onkologie a interních chorob Lékařské univerzity ve Varšavě. Na 1. lékařské fakultě Varšavské lékařské univerzity obhájila titul doktora lékařských věd v oboru lékařské biologie. Autor mnoha vědeckých a populárně-vědeckých prací v oblasti laboratorní diagnostiky, molekulární biologie a výživy. Denně jako specialista v oblasti laboratorní diagnostiky vede věcné oddělení v Cambridge Diagnostics Polska a spolupracuje s týmem dietologů na CD Dietary Clinic. Své praktické poznatky z diagnostiky a dietoterapie nemocí sdílí s odborníky na konferencích, školeních a v časopisech a na webových stránkách. Zvláště se zajímá o vliv moderního životního stylu na molekulární procesy v těle.